唐尧生物科技
济南华维医药科技有限公司
Huawei Pharmaceutical Co. Ltd.
  • 服务描述
  • 4.2.4 蛋白免疫印迹Western blot 实验

    【生物背景】

    培养的细胞,经过药物处理完后,用冰冷的PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)洗一次,然后加入的1×SDS样品缓冲液 (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 100 mM DTT, 2 % SDS, 0.1 % Bromophenol Blue, 10 % glycerol) 裂解细胞。细胞裂解物用沸水浴加热10分钟后,于12000g离心5分钟,取上清。取等量蛋白在电泳缓冲液(25 mM Tris,250 mM 甘氨酸,0.1% SDS,pH 8.3)中进行SDS-PAGE电泳。电泳完后,用湿转法将蛋白转至PVDF (polyvinylidine difluoride)膜上,其中所用缓冲液为转移缓冲液(25 mM Tris,200 mM 甘氨酸),转膜电流为25 mA,转移时间为2小时。转膜完成后,将膜置于封闭液 [5 % 脱脂奶粉,TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 % Tween 20, pH 7.6)]中于摇床上室温封闭1小时,然后与相应的一抗4℃于摇床上孵育过夜。用TBST洗涤3次,每次15分钟后,加入辣根过氧化酶标记的二抗,于摇床上室温孵育2小时。TBST洗涤3次,每次15分钟。最后,用SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Inc, Rochford, IL)发色后,压片、显影、定影。




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    Western blot 实验

    Western blot 实验

     

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    周期:4-6

    送样量2~3mg

    每个化合物测试每个细胞株的一种蛋白:260/孔。(起测量至少10个孔)

    注:一抗抗体需要客户自己提供,或由我们代为购买,二抗抗体免费。

          

    【结果例】




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